Angelotti, un prisionero político que acaba de escaparse de la prisión del Castel Sant’Angelo, entra corriendo en la iglesia de Sant’Andrea della Valle, busca una llave y la utiliza para abrir una capilla privada, en la que se esconde. El sacristán no para de trajinar de acá para allá y el pintor Mario Cavaradossi sigue trabajando en un cuadro que representa a María Magdalena. Ha utilizado como modelo a una mujer rubia que ha estado frecuentando la iglesia. Aunque admira su belleza rubia, prefiere el encanto moreno de su amada, la famosa cantante Floria Tosca. Cuando desaparece el sacristán, Angelotti sale de su escondite y Cavaradossi lo reconoce enseguida como un compañero de ideas revolucionarias. Se oye la voz de Tosca llamando a Cavaradossi y este aconseja a Angelotti que vuelva a esconderse, dándole una cesta con comida que había dejado para él el sacristán. Tosca, al oírle hablar, sospecha de que ha estado cortejando a una mujer. Él la tranquiliza y ambos aguardan con ilusión el momento en que podrán reunirse en la villa del pintor después del concierto que ofrecerá ella esa noche. La cantante está a punto de irse cuando ve el cuadro, lo que vuelve a despertar sus celos, sobre todo cuando reconoce que la modelo ha sido la marquesa Attavanti. Cavaradossi le asegura que no conoce a la mujer, pero que sí la ha visto en la iglesia. Ella se va, advirtiéndole que pinte a su María Magdalena con los ojos negros. Angelotti, que vuelve a salir de la capilla, revela que la marquesa Attavanti es su hermana, por lo que su presencia en la iglesia se debía en parte a que le he llevado ropas de mujer para facilitar que lo reconozcan en su huida y las ha dejado escondidas en la capilla familiar. Cavaradossi le ofrece refugio en su villa en las afueras de la ciudad, pero, antes de que pueda marcharse, un cañonazo es la señal que anuncia que su fuga ha sido descubierta. Cavaradossi lo acompaña y ambos salen de la iglesia.

El sacristán, que acaba de enterarse de la noticia de la derrota de Napoleón en Marengo, pide a los niños cantores que se preparen para cantar un Te Deum celebratorio. Su ruidosa celebración se ve interrumpida por la llegada de Scarpia, el jefe de policía, con algunos de sus agentes. Una búsqueda confirma sus sospechas de que Angelotti se ha escondido en la iglesia y una pista es un abanico que se le caído a Angelotti. Tosca, que ha regresado para decir a su amante que esa noche llegará tarde porque tiene que cantar en una cantata para celebrar la victoria, queda desconcertada al ver que Cavaradossi se ha ido. Scarpia, que lleva tiempo observando a Tosca con ojos lujuriosos, sospecha que el pintor ha ayudado a Angelotti a escapar, por lo que se vale de los celos de Tosca con la esperanza de que ella lo conducirá hasta Angelotti. Él le enseña el abanico, arguyendo que lo ha encontrado cerca del andamio del pintor, lo que indicaría una cita bruscamente interrumpida.

Tras reconocer en el abanico el escudo de armas de los Attavanti, ella se muestra convencida de que Cavaradossi le ha sido infiel y se dirige a la villa para encontrar a los supuestos amantes. Scarpia ordena a sus agentes que la sigan y se congratula del éxito de sus inmediatos planes al tiempo que suena la música del Te Deum.

El segundo acto nos traslada a la estancia privada de Scarpia en la Villa Farnese esa misma noche. El jefe de policía está cenando mientras espera que lleguen sus agentes con noticias sobre Angelotti. Envía una nota invitando a Tosca a visitarlo después de la cantata conmemorativa. Se enfurece cuando su agente Spoletta la confiesa que no han encontrado ni rastro de Angelotti, pero se alegra cuando le informa de que sí han arrestado a Cavaradossi debido a su conducta sospechosa. El pintor desafía a Scarpia y niega saber nada sobre Angelotti. Scarpia ordena entonces un interrogatorio, valiéndose de todos los medios que sean necesarios, incluida la tortura. No consigue que funcione su estratagema de engañar a Tosca para que revele el paradero de Angelotti, pero ella se muestra incapaz de seguir resistiendo los gritos de dolor de Cavaradossi mientras es torturado en la estancia contigua. Al final se derrumba y desvela el escondite de Angelotti en el pozo del jardín de la villa del pintor.

Cavaradossi, furioso, la maldice por su debilidad. Cuando llega la noticia de que es Napoleón quien ha salido victorioso, y no derrotado, en la batalla de Marengo, se burla exultante de Scarpia, que ordena su ejecución inmediata. En un principio, Scarpia hace oídos sordos a las súplicas de Tosca para que no mate a su amado, pero finalmente revela que el precio para salvar la vida de Cavaradossi es que Tosca se entregue a él. Desesperada, ante la imposibilidad de encontrar otra salida y a pesar de la repulsión que le produce, y que la hace más deseable a los ojos de Scarpia, acepta el trato. En presencia de Tosca, Scarpia da la orden para que se lleve a cabo una ejecución simulada, aunque se expresa de tal modo que Spoletta comprende perfectamente, aunque no Tosca, que la ejecución será real. Ella exige un salvoconducto para que ella y Cavaradossi puedan abandonar Roma para siempre. Mientas él está escribiéndolo, ella ve un cuchillo en la mesa y, cuando Scarpia se acerca a ella para abrazarla, Tosca lo clava en su pecho y lo mata. Coloca sendas velas a uno y otro lado del cadáver postrado en el suelo, sobre cuyo pecho deposita también un crucifijo.

El tercer acto se inicia poco antes del amanecer, esa misma noche. Un niño pastor canta a lo lejos y las campanas de las iglesias de Roma tocan a maitines. En la plataforma del Castel Sant’Angelo, Cavaradossi intenta escribir una última carta a Tosca, pero se lo impiden los recuerdos de su felicidad pasada. Tosca llega luego corriendo con el salvoconducto y le confiesa que ha matado a Scarpia. Le informa sobre la ejecución que ella cree fingida y le instruye sobre cómo tiene que dejarse caer y esperar hasta que se hayan ido los soldados para incorporarse. Sin embargo, el fusilamiento es real y, al ver que Mario no se mueve, Tosca se da cuenta de que está muerto. Gritos airados, cada vez más cercanos, indican que la muerte de Scarpia ha sido descubierta y Spoletta persigue a la asesina Tosca con un grupo de soldados para evitar que huya. Sin embargo, antes de que la alcancen, ella se arroja al vacío desde lo alto del Castel Sant’Angelo.