Acto I.
Cuadro 1: una cueva tenebrosa.
Un grupo de cristianos se reúne en secreto para asistir al bautismo de Poliuto. Nearco tranquiliza al nuevo converso, confiando en que la comunión sosiegue su alma. Pero Poliuto confiesa que no se trata tan sólo de su fe, sino de celos: Callistene ha sembrado en su corazón la duda sobre la fidelidad de su esposa. Nearco aboga por su inocencia y sugiere a Poliuto que implore la ayuda divina, pues el dios cristiano nunca abandona a los necesitados. Paolina sospecha que Poliuto ha abrazado la religión prohibida; siguiéndole, descubre la cueva. Nearco encomienda a un grupo de cristianos que vigilen la entrada durante la ceremonia. Paolina les descubre e interroga al patriarca, quien confirma sus sospechas. Nearco le suplica que guarde silencio para proteger a su esposo de la ley que castiga a los conversos con la muerte. Desde el interior se escucha la plegaria de Poliuto; Paolina se estremece ante la fuerza que emana del canto, invadiendo su alma y llenándola de esperanza. Al descubrir a su esposa, Poliuto confiesa que ha recibido la llamada del dios verdadero y no teme el castigo. Nearco anuncia la llegada de Severo, el terrible procónsul, íntimo del emperador y temido por los suplicios que infringe a los cristianos. Paolina apenas puede contener la emoción al descubrir que su antiguo amor, a quien daba por muerto, regresa al frente de las legiones romanas.

Cuadro 2: En la plaza pública de Mitilene.
Severo y sus legiones son recibidos entre el clamor popular. El emperador Decius le ha enviado a Armenia para exterminar a los rebeldes cristianos, pero Severo solo piensa en volver a ver a Paolina, a quien no ha dejado de amar en la distancia. Su sueño se desvanece al descubrir que ella se ha casado con Poliuto.

ACTO II.
Cuadro 1: El patio en la casa de Felice.
Callistene conduce a Severo a casa de Felice, haciendo ver que Paolina es muy desgraciada en un matrimonio al que accedió en contra de su voluntad. El sumo sacerdote abandona el patio y entra Paolina, a quien la visión de su antiguo amor ha dejado en un estado de tremenda confusión. Severo insiste desesperadamente en su pasión; ella confiesa que su corazón está roto de dolor, pero le ruega que se vaya. Severo atiende su súplica, jurando que nunca dejará de amarla. Maquiavélicamente, Callistene se ha asegurado de que Poliuto sea testigo mudo de este encuentro y ahora éste, convencido de la culpabilidad de su esposa, clama venganza. Un hermano cristiano se acerca para informarle de la detención de Nearco, encadenado en el templo de Júpiter. Ante la terrible noticia, el ansia de venganza de Poliuto se diluye, aceptando los designios de la divina providencia.

Cuadro 2: El templo de Júpiter.
El sacrificio tiene lugar en el templo, donde las plegarias del pueblo se entremezclan con las diatribas de los sacerdotes contra los herejes. Callistene acusa a Nearco de ser un sacerdote cristiano y haber convertido recientemente a un neófito. El acusado se declara culpable, pero se niega a traicionar a uno de los suyos. Severo le condena a ser torturado hasta que confiese. En ese mismo instante aparece Poliuto, quien, ante el asombro de Callistene y Felice, confiesa ser el neófito que buscan. Paolina, desesperada, implora la ayuda del dios de los cristianos. Seguidamente se postra a los pies de su padre y de Severo, en un último intento de ablandar su corazón con su dolor. Indignado ante la conducta de su esposa, Poliuto reniega de los lazos que les unieron un día ante un falso dios. Felice ofrece consuelo a su hija.

ACTO III.
Cuadro 1: Una arboleda sagrada.
El pueblo entero se dirige al circo, anticipando el espectáculo del martirio de los cristianos. Ante el temor de que Paolina consiga finalmente convencer a Severo de que perdone a su esposo, Callistene y sus sacerdotes alimentan el deseo sangriento del pueblo.

Cuadro 2: Los calabozos del circo.
Poliuto despierta de un sueño en el que una visión divina le revela la inocencia de su esposa. Al entrar, Paolina admite que Severo fue su gran amor, pero asegura haber sido fiel a sus votos, al vencer la tentación en su último encuentro. En cuanto a Callistene, sus calumnias eran fruto de la impúdica pasión que siente por ella. Poliuto respira aliviado; ahora ya puede morir feliz. Paolina le suplica por última vez que renuncie a su nueva fe, pero, inspirada por el coraje de su esposo, abraza con fervor el cristianismo y decide compartir su destino. Tras un primer momento de confusión, Poliuto bautiza a su esposa.

Cuadro 3: Las puertas abiertas revelan el anfiteatro lleno de gente.
Severo ofrece a Poliuto una última opción para salvar su vida, pero él la rechaza. Mientras, Paolina confiesa que se ha convertido al cristianismo y compartirá el martirio con su esposo. Severo intenta en vano disuadirla con la excusa del dolor que su muerte causará a su padre. Con la visión de una dicha eterna en el paraíso, Paolina y su esposo salen a la arena.