ACTO I.
Por la noche en los aposentos de la reina en el Castillo de Windsor.
Un secreto a voces recorre la corte: la reina Anna Bolena está triste. Su marido, el rey Enrico VIII, la trata con desdén y frialdad, en un vano intento de ocultar que su corazón pertenece a otra mujer. Se trata de Giovanna Seymour, dama de compañía de la reina, quien ha accedido gustosa a los avances de su señor. En una cita secreta, el rey promete a Giovanna que tendrá esposo, cetro y trono: odia a la reina, a quien acusa de haberle engañado al entregarle un corazón que no era suyo, y amenaza con castigarla por ello. Parque que rodea el Castillo de Windsor. Lord Rochefort, hermano de la reina, saluda sorprendido a Lord Percy, el inolvidable primer amor de Anna que regresa de un largo exilio. Percy admite su preocupación por los rumores sobre el triste estado de la reina, y confiesa que su vida ha sido un infierno lejos de ella. Su regreso ha sido orquestado por Enrico como parte de un plan para deshacerse de su esposa. De ahí su satisfacción por la emoción de los amantes al reencontrarse ante los participantes en la cacería. Antecámara de los aposentos de la reina en el Castillo de Windsor. En el gabinete que comunica con los aposentos de Anna, Smeton, su músico de cámara y secreto admirador, se dispone a devolver un medallón con una imagen robada de la reina. Unos ruidos le obligan a esconderse tras un cortinaje. Se trata de Anna, que, contraviniendo toda prudencia, accede a la petición de Rochefort de reunirse con Percy en la intimidad. Fiel a su matrimonio y su corona, la reina rechaza el amor de Percy, suplicándole que abandone el país para siempre. Desesperado, Percy está dispuesto a quitarse la vida. Smeton intenta detenerle justo cuando el rey hace su aparición, acusando a Anna de traición. El músico deja caer el medallón a los pies del rey, prueba inefable que condena a Anna, Percy y Smeton a prisión.

ACTO II.
Londres, antecámara de los aposentos de la cautiva reina.
Anna entra rodeada de las damas que aún permanecen fieles a su lado a pesar de las circunstancias. Mientras ellas intentan consolarla, Harvey aparece con un encargo del Consejo de los Pares: se requiere la presencia inmediata de las damas en calidad de testigos para el juicio. Abandonada a su suerte, Anna llora y suplica piedad al cielo. En este estado la encuentra Seymour, quien, postrada a sus pies, le indica que puede salvar la vida si se confiesa culpable. Anna se indigna ante la sola idea de comprar su vida con la infamia, y exige conocer el nombre de su sucesora. Incapaz de callar por más tiempo, Seymour confiesa su traición y suplica el perdón de su señora. Londres, antecámara de la sala del Consejo de los Pares. Con la esperanza de salvar a su amada de una muerte cierta, Smeton miente en el juicio ante los Pares, admitiendo ser su amante. Desgraciadamente, se trata de una trampa preparada por Enrico para deshacerse de su esposa, y esta declaración sella el destino fatal de la reina. Anna y Percy llegan para comparecer ante el Consejo. Al verla, Enrico la acusa de haberle sido infiel con Smeton; ella responde indignada acusando a su marido de soborno a la justicia. Percy defiende con ardor la inocencia de su amada y confiesa que, a los ojos del cielo, Anna y él son esposos. Los guardas conducen a los amantes ante el Consejo. Presa del remordimiento, Seymour no se resigna a ser la causa de la muerte de su reina y amenaza a Enrico con abandonarlo todo si no se muestra clemente. Esta actitud no consigue ablandar el corazón del rey, sino que su odio hacia Anna crece al comprobar la aflicción que causa en su amada. Harvey anuncia que el Consejo ha resuelto disolver los vínculos reales, condenando a Anna y sus cómplices a muerte. Seymour suplica clemencia al rey, que desaparece en la sala del Consejo. La Torre de Londres. Harvey anuncia que el rey ha perdonado la vida a Percy y a Rochefort, pero Anna debe cumplir la sentencia. Percy aboga por su inocencia y rehúsa la clemencia si no es para compartirla con su amada; Rochefort le secunda. En la celda de la reina, sus damas temen que haya perdido la razón. Completamente fuera de sí, Anna revive con detalle el día en que, abandonando a su amor de la infancia, se unió a Enrico en matrimonio. A continuación le parece ver a Percy, quien, sonriente, se ofrece a llevarla a su castillo natal, donde olvidará las penas pasadas. Smeton se postra a los pies de Anna, suplicando su perdón por haber caído en la trampa de Enrico. Presa del delirio, la reina le pregunta por su laúd. Los cañonazos y el repicar de las campanas le devuelven a la cruda realidad: Seymour ha sido proclamada reina. Anna se desvanece cuando llegan los guardias para conducirlos a la ejecución.