La plaza de la ciudad de Gaza, con el templo de Dagón a la izquierda. Es de noche. Mientras que el resto de los hebreos están llorando su suerte, Sansón sigue teniendo fe en la promesa de libertad de Dios. Cuando entra Abimélech, el sátrapa filisteo, se burla del Dios de los hebreos, proclamando la superioridad de Dagón, lo que provoca que los hebreos se sientan atemorizados. Pero el fervor de Sansón les anima a desafiar a Abimélech. Este ataca a Sansón con su espada, pero el judío logra atraparla y es él quien lo mata. Los hebreos se dispersan y aparece el Sumo Sacerdote, que maldice a los hebreos y a su líder. Cuando un mensajero informa de que los hebreos están arrasando la cosecha, el Sumo Sacerdote los maldice.

Amanece y los hebreos regresan para ofrecer una plegaria al Todopoderoso, en este caso en un humilde unísono, en contraste con la riqueza polifónica y contrapuntística del coro inicial. Llega Dalila acompañada de jóvenes filisteas, que cantan a las delicias de la primavera. Dalila declara que Sansón ha conquistado su corazón y lo invita a unirse a ella en su morada del valle de Soreck. Sansón reza para protegerse de sus encantos y un anciano hebreo le advierte de los peligros que ello entrañaría. Las sacerdotisas bailan una danza voluptuosa y a continuación Dalila vuelve a cantar a la primavera, tras lo cual el anciano hebreo repite su advertencia. Sansón lucha con su deseo de mirar a los ojos a Dalila, consciente de que rendirse a él provocará su perdición.

En el segundo acto, Dalila está sentada sobre una roca a la puerta de su morada en el valle de Soreck. Se alegra del poder que tiene sobre Sansón y se muestra convencida de que él acabará cayendo presa de sus encantos. Se ven y oyen los relámpagos y los truenos de una tormenta cada vez más cercana. Llega el Sumo Sacerdote e informa a Dalila de que los hebreos han derrotado a los filisteos. Le ofrece oro por capturar a Sansón, pero ella se niega, ya que actúa impulsada únicamente por el odio y la lealtad a sus dioses. Cantan un enérgico dúo de odio y ella promete averiguar el secreto de la fuerza de Sansón.

Cuando se queda sola, Dalila se pregunta si logrará su propósito. Al poco rato aparece Sansón, que ha venido a darle su último adiós, consciente de que el deber le reclama para conducir a los hebreos a la victoria. Como parecía inevitable, y tras los requerimientos de Dalila, Sansón acaba admitiendo que él también la ama. Tras cantar el aria más famosa de la obra, en la que le pide reverdecer su antiguo amor, Dalila pretende dudar del amor de Sansón y le pide que revele el secreto de su fuerza, pero él se niega a hacerlo. El estruendo de los truenos son interpretados por Sansón como manifestaciones de la ira de Dios. Ella lo desprecia y corre hacia el interior de su morada. Sansón, después de dudar, la sigue enseguida. En ese momento salen de su escondite varios soldados filisteos y Sansón se da cuenta enseguida de que ha sido traicionado.

En una prisión de Gaza, Sansón, ciego y encadenado, con sus cabellos cortados, hace girar la rueda de un molino. Apesadumbrado y presa del remordimiento, Sansón ofrece su vida en sacrificio al tiempo que se oye a lo lejos a los hebreos lamentando la caída de su líder. En el interior del templo de Dagón, los filisteos están preparando un sacrificio para celebrar su triunfo y la escena desemboca en una desenfrenada bacanal. A continuación, entra Sansón, guiado por un niño, y tanto el Sumo Sacerdote como la multitud se burlan de él. Dalila admite que ha fingido que lo amaba por odio y por un deseo de venganza, por lo que ya no queda ninguna duda de su traición. Los filisteos siguen con sus celebraciones en honor de Dagón y el Sumo Sacerdote pide al niño que conduzca a Sansón hasta el centro del templo para que todos puedan verlo y burlarse de él. Sansón le susurra que lo conduzca hasta las dos columnas de mármol que sostienen el edificio. Cuando las celebraciones llegan a su clímax, Sansón invoca a Dios para que le deje consumar su venganza y, con un esfuerzo supremo, logra derribar las columnas, lo que provoca que todo el templo se derrumbe, aplastando bajo las ruinas a todos los filisteos y a él mismo. Inmediatamente después, cae el telón.